Sažetak

Bez obzira na to što je rezistencija bakterija na antibiotike (antimikrobna otpornost) jedan od glavnih izazova moderne medicine, klamidijska je infekcija dosad pokazivala dobar klinički odgovor na lijek prvog izbora – azitromicin. Ipak, u literaturi postoje ponovljeni opisi laboratorijski dokazane rezistencije spolno prenosive bakterije Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) koja uzrokuje ovu infekciju. Osim toga, Hrvatska je zemlja s visokom stopom propisivanja azitromicina i drugih antimikrobnih lijekova, što može utjecati na pojavu otpornosti ili slabijeg odgovora na terapiju. U skladu s time cilj prvoga hrvatskog istraživanja antimikrobnog profila C. trachomatis bio je utvrditi djelotvornost azitromicina i drugih antibiotika prema urogenitalnim kliničkim izolatima C. trachomatis u laboratorijskim uvjetima. U staničnome modelu McCoyevih stanica određivane su minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) i minimalna klamidicidna koncentracija (MCC), a svi ispitivani sojevi bili su osjetljivi na azitromicin (MIC < 4 μg/ml). Premda rezistentni sojevi bakterije nisu nađeni, kod određenih izolata uočene su znatno više vrijednosti MCC-a za azitromicin, što pokazuje trend moguće smanjene osjetljivosti. Bez obzira na zahtjevnu metodologiju, potrebno je nastaviti s ovakvim istraživanjima, poglavito u zemljama s velikim opterećenjem propisivanja antibiotika.

Uvod

Klamidijaza je najčešća bakterijska spolno prenosiva zarazna bolest na svijetu uzrokovana bakterijom Chlamydia trachomatis. U velikom postotku slučajeva infekcija je asimptomatska, što posljedično povisuje rizik od razvoja komplikacija (poput zdjelične upalne bolesti). Terapija prvog izbora već je dulje vrijeme azitromicin (1 g oralno jednokratno).

Rezistencija ili otpornost bakterija na antimikrobne lijekove nesumnjivo je jedan od glavnih izazova današnje medicine koji dovodi u pitanje ne samo uspješno liječenje zaraznih bolesti već i daljnji znanstveni i medicinski napredak (1). Uvođenje penicilina u redovitu kliničku praksu ranih četrdesetih godina prošlog stoljeća (2) te posljedični razvoj brojnih novih antibiotika (3) rezultirali su visokim stupnjem zdravstvene zaštite kakva nam je danas poznata. S druge strane, širenje rezistencije zbog brzog evolucijskog prilagođavanja različitih bakterijskih vrsta te povećane potrošnje lijekova postali su svakodnevica – i u bolničkim sredinama i izvan njih (4). Uzevši u obzir da je 80% kliničkih izolata bakterije Neisseria gonorrhoeae (uzročnika gonoreje) danas otporno na neki od antimikrobnih lijekova, kao i godišnju pojavnost od 440.000 slučajeva multirezistentne tuberkuloze (što su samo dva eklatantna primjera fakultativno unutarstaničnih bakterija), velik broj stručnjaka slaže se da smo već duboko zagazili u tzv. postantibiotsku eru (5).

Klamidijaza je najčešća bakterijska spolno prenosiva zarazna bolest na svijetu uzrokovana bakterijom Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) (6). Premda se kod muškaraca i žena infekcija može manifestirati upalom mokraćne cijevi, a kod žena još i upalom vrata maternice, u velikom postotku slučajeva infekcija je asimptomatska, što posljedično povisuje rizik od razvoja komplikacija (poput zdjelične upalne bolesti) (7). U skladu s time nužna je pravodobna i pouzdana laboratorijska dijagnostika ove infekcije kako bi se u slučaju pozitivnog nalaza što prije provelo liječenje (6, 7). Terapija prvog izbora već je dulje vrijeme azitromicin (1 g oralno jednokratno), a može se primijeniti i doksiciklin (2 × 100 mg na dan tijekom 7 dana) (6).

Dosad se rezistenciji C. trachomatis u ljudi nije pridavala velika pozornost, ponajviše s obzirom na činjenicu da se ovaj mikroorganizam razmnožava samo u citoplazmi stanice osjetljivog domaćina, zbog čega je stjecanje rezistencije rijedak moment u vrlo specifičnom životnom ciklusu bakterije (8). Ipak, kontinuirana i ponavljana primjena antibiotika može za posljedicu imati razvoj tzv. kompenzatornih mutacija u određenim klamidijskim izolatima, bez obzira na eventualno žrtvovanje nekih drugih kolonizatorskih sposobnosti organizma zbog takvih mutacija (tzv. fitness cost) (9). Osim toga, mogućnost selektiranja antimikrobne rezistencije kod izlaganja subinhibitornim koncentracijama antibiotika u laboratorijskim uvjetima sugerira da bi sličan mehanizam mogao biti potencijalan izvor rezistentne C. trachomatis kod ljudi ili životinja izloženih antimikrobnoj terapiji (10).

Među članicama projekta The European Surveillance of Antimicrobial Consumption (ESAC), koji je kao cilj imao praćenje uporabe antimikrobnih lijekova u pojedinim europskim zemljama, Hrvatska s 23,37 DDD na 1000 stanovnika spada među države s velikom izvanbolničkom potrošnjom antibiotika (11). Stanje je još izraženije u gradu Zagrebu, gdje je 2010. godine potrošnja bila 33,28 DDD na 1000 stanovnika (12). Osim toga, prema istraživanju iz 2010. godine, stope propisivanja azitromicina i sulfonamida u našoj zemlji bile su najviše u Europi (13). Takva pretjerana potrošnja antimikrobnih lijekova nesumnjivo je znatan rezervoar stvaranja i daljnjeg širenja antimikrobne rezistencije.

Sve su to razlozi zbog kojih je prvi put u Hrvatskoj provedena studija radi definiranja antimikrobnog profila kliničkih izolata C. trachomatis kako bi se dobio uvid u koncentracije antibiotika potrebne da zaustave infekciju u laboratorijskome modelu (14 – 16). Nit vodilja istraživanja bila je preciznija procjena učinkovitosti standardno propisivane terapije, moguće otkrivanje rezistentnih ili slabije osjetljivih klamidijskih izolata, stvaranje baze antimikrobnog profila kliničkih sojeva te (prema potrebi) revizija terapijskih smjernica (14). Na antibiotik azitromicin (kao prvi izbor u liječenju ove infekcije) stavljen je poseban naglasak.

Materijali i metode

Pri testiranju antimikrobne osjetljivosti klamidijskih sojeva posebnu pozornost valja obratiti na uvjete koji utječu na sposobnost C. trachomatis da inficira stanice u kulturi, kao i na aktivnost izabranog antimikrobnog lijeka u laboratorijskome modelu (10). Radi smanjenja potencijalne varijabilnosti rezultata, valja se odlučiti za staničnu liniju s malim brojem pasaža uz obvezatnu kontrolu kvalitete. Iako je stanična kultura uniformnog (tj. polariziranog) rasta generalno konzistentnija u prihvatu antibiotika, ona je tehnički znatno zahtjevnija te se stoga rijetko rabi. Nadalje, razrjeđenja antibiotika potrebno je prirediti tako da se osigura njihova prikladna potencija, što znači da se pripremaju neposredno prije dodavanja u netom inficirane stanice (14).

U prvome hrvatskom istraživanju antimikrobne osjetljivosti urogenitalnih klamidijskih sojeva rabljene su McCoyeve stanice, što je kontinuirana stanična kultura fibroblasta adherentnog rasta iz domaćeg miša (Mus musculus) (14). Suspenzija stanica pripremljena je u čistom Eaglovu minimalnom esencijalnom mediju (MEM-u) s desetopostotnim fetalnim serumom (bez dodatka antibiotika i cikloheksimida), a zatim je rastočena u mikrotitarsku pločicu po 100 µl u mikrotitarsku pločicu s 96 jažica. Četrdeset kliničkih izolata C. trachomatis (izoliranih iz obrisaka vrata maternice, obrisaka mokraćne cijevi i eksprimata prostate) te dva referentna soja umnoženi su do veličine inokuluma (5000 – 10.000 inkluzijskih jedinica po jažici mikrotitarske pločice), što znači da su inficirali stanice u znatnom broju kako bi se mogao prikladno ispitati njihov antimikrobni profil.

Za svaki umnoženi soj upotrijebljeno je razrjeđenje antibiotika u rasponu od 0,008 do 8 µg/ml, s planiranim povišenjem koncentracije u slučaju detekcije rezistentnih, tj. slabije osjetljivih sojeva. Pri testiranju istodobno su upotrijebljene dvije mikrotitarske pločice: jedna u kojoj se određivala minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) i druga u kojoj se određivala minimalna klamicidna koncentracija (MCC) lijeka. Za detekciju klamidijskih inkluzija upotrijebljena su monoklonska protutijela obilježena fluoresceinom.

Vizualizacija inkluzija obavljena je s pomoću invertnoga fluorescentnog mikroskopa, uz precizno definiranje MIC-a i MCC-a. Sukladno drugim istraživanjima u ovom području (10, 17 – 19) MIC je tako mikroskopski definiran kao najniža koncentracija antimikrobnog lijeka kod koje nema vidljivih klamidijskih inkluzija, a označava jedno razrjeđenje više od MIC_TP-a (što je koncentracija antibiotika kod koje dolazi do znatne promjene u broju i morfologiji inkluzija). S druge strane, MCC je mikroskopski definiran kao koncentracija antimikrobnog lijeka kod koje nije bilo vidljivih inkluzija nakon pasaže soja iz stanične kulture gdje je bio dodan antibiotik na staničnu kulturu bez antibiotika.

Rezultati

Prvo istraživanje osjetljivosti urogenitalnih klamidijskih sojeva u Hrvatskoj pokazalo je potpunu osjetljivost svih ispitivanih izolata (dakle iz obrisaka vrata maternice, obrisaka mokraćne cijevi te iz eksprimata prostate) na antibiotik azitromicin. Drugim riječima, obrazac „homotipne“ ili „heterotipne“ rezistencije nije nađen ni kod jednoga klamidijskog izolata podvrgnutog testiranju.

Ipak, specifična analiza bila je potrebna da bi se dobio uvid u konkretne vrijednosti MIC-ova i MCC-ova azitromicina za izolate iz različitih anatomskih sijela. Postotni udio MIC-ova i MCC-ova azitromicina za klamidijske sojeve izolirane iz obrisaka vrata maternice prikazan je na slikama 1. i 2., za sojeve iz obrisaka mokraćne cijevi kod muškaraca i eksprimata prostate na slikama 3. i 4., a grupno za sve izolate na slikama 5. i 6. Medijan MIC-a azitromicina iznosio je 0,64 μg/ml, a medijan MCC-a 0,125 μg/ml, no u navedenim prikazima vidljiv je uski koncentracijski raspon kod MIC-ova, a širi koncentracijski raspon kod MCC-ova.

Usporedbom koncentracijskih medijana izolata iz različitih sijela nije nađena statistički značajna razlika između obrisaka vrata maternice, obrisaka muške uretre zajedno s eksprimatom prostate te referentnih sojeva (p > 0,05), što je potvrđeno i post-hoc analizom višestruke usporedbe u odnosu prema jednoj prilagođenoj p-vrijednosti (p = 0,05) (tablica 1.). Dakle, bez obzira na anatomsko sijelo kliničkog izolata C. trachomatis, azitromicin se u laboratorijskim (in vitro) uvjetima pokazao jednako učinkovitim.

Tablica 1. Post-hoc analiza višestruke usporedbe minimalne inhibitorne koncentracije (MCC) i minimalne klamicidne koncentracije (MCC) različitih kliničkih uzoraka za azitromicin u odnosu prema jednoj prilagođenoj p-vrijednosti (p = 0,05) pokazuje da nema statistički značajnih razlika u odnosu prema anatomskom sijelu uzorka (14).

Rasprava

Profil antimikrobne osjetljivosti C. trachomatis ne ovisi samo o antibiotskom opterećenju nego i o okolišnim uvjetima te čimbenicima specifičnim za stanice domaćina (20). U ovome prvom hrvatskom istraživanju antibiotske osjetljivosti klamidijskih izolata iz mokraćno-spolnog trakta azitromicin se pokazao kao lijek koji i dalje pokazuje izvrsnu antimikrobnu djelotvornost u uvjetima in vitro (14 – 16), što se potvrđuje i kliničkim odgovorom pacijenata na propisani lijek. Isto tako ovi se rezultati podudaraju s obrascem laboratorijske osjetljivosti klamidijskih sojeva u drugim sličnim istraživanjima u medicinsko-znanstvenoj literaturi (10, 17 – 19).

No iako se u novim studijama in vitro potvrđuje dobra osjetljivost klamidijskih izolata na antimikrobne lijekove iz standardno propisivanih skupina, čini se da je rezistencija urogenitalnih klamidijskih sojeva na makrolide (ali i tetracikline i fluorokinolone) itekako moguća (20). Više istraživača objavilo je opise rezistentnih klamidijskih sojeva uz prikladnu kliničko-laboratorijsku korelaciju (21 – 26). Svi takvi rezistentni izolati pokazivali su obrazac „heterotipne rezistencije“, tj. fenomen gdje samo malen broj mikroorganizama (tek 1% bakterijske populacije) preživljava vrlo visoke koncentracije antibiotika (10).

Kao glavni pokretač u razvoju rezistencije klamidijskih sojeva sve se više implicira lateralni prijenos gena, što je proces prepoznat u evoluciji tog uzročnika (27, 28). Takav prijenos genskog materijala u slučajevima miješanih infekcija s različitim klamidijskim sojevima lako se može detektirati u laboratorijskim uvjetima (29). Neka istraživanja ističu da je barem nekoliko postotaka infekcija u ljudi uzrokovano višestrukim sojevima C. trachomatis, što otvara vrata za njihovu rekombinaciju (30). Premda se smatra da je prijenos gena rezistencije ovim mehanizmom rijedak moment, svakako su potrebna dodatna istraživanja na kliničkim izolatima (i to ponajprije rezistentnim) te primjena funkcionalne i komparativne genomike kako bi se odredili stupanj i raznolikost rekombinacije (31).

Pojava klamidijskih izolata rezistentnih na antibiotike generalno se može očekivati tek nakon višestruko provedenih kura liječenja. Ako povučemo paralele s bakterijom Streptococcus pneumoniae (važan uzročnik upale pluća), kod nje se rezistencija na azitromicin očituje tek nakon uzastopnih godišnjih terapijskih režima radi liječenja klamidijske infekcije poznate kao trahom (32). Dakle, selektivni pritisak ponavljane distribucije azitromicina mogao bi omogućiti brzo širenje rezistentnih klonova (33). Upravo je zbog toga opravdano pitanje ima li široka potrošnja antimikrobnih lijekova i u kojoj mjeri utjecaj na profil osjetljivosti sojeva C. trachomatis. Odgovore na takva pitanja treba tražiti ovom vrstom probira antimikrobne osjetljivosti kliničkih klamidijskih izolata u zemljama s visokom stopom propisivanja antibiotika.

Iako rezistencije na azitromicin u istraživanju nije bilo te su vrijednosti MIC-a bile i više nego zadovoljavajuće, MCC za azitromicin dosegnuo je 2 μg/ml, što je uz samu granicu rezistencije koja (sukladno konsenzusu stručnjaka u ovom području) iznosi 4,0 μg/ml. Premda je samo jedan klinički izolat iz hrvatskih pacijenata dosegao tu koncentraciju (slika 4.), MCC za azitromicin iznosio je 1,0 μg/ml kod čak 23,5% izolata iz obrisaka muške uretre i eksprimata prostate (slika 4.) te kod 12,5% svih testiranih izolata (slika 6.). Dakako, navedeno je daleko od bilo kakve laboratorijske (a napose klinički) važne otpornosti, ali svakako pokazuje trend moguće smanjene osjetljivosti koji bi trebalo nastaviti nadzirati.

S obzirom na to treba naglasiti i rezultate hrvatskog istraživanja na uzorku od 150 pacijentica s akutnim uretralnim klamidijskim sindromom (34). Naime, u skupini žena kod kojih su kliničke tegobe prije početka terapije trajale tri tjedna ili više, puno bolje izlječenje uz eradikaciju postignuto je nakon administracije azitromicina u dozi od 500 mg na dan tijekom šest dana nego nakon jednokratne doze od jednoga grama (34). Osim toga, neki autori savjetuju kombiniranu terapiju makrolidima i fluorokinolonima radi bolje sigurnosti u eradikaciji C. trachomatis, napose u muških pacijenata sa simptomima kroničnog prostatitisa (35). Upravo je to populacija kod koje bi trebalo provesti ovakvu vrstu probira kako bi se vidjelo radi li se možda o klamidijskim sojevima s višim vrijednostima MIC-a ili MCC-a.

S druge strane, iskustva iz drugih grana mikrobiologije uče nas koliko je zapravo dug put do standardizacije određenih metoda za određivanje antimikrobne osjetljivosti; primjerice, ni danas još ne možemo prikladno interpretirati MIC-ove za velik broj gljivnih izolata (36, 37). Za klamidijske izolate možemo reći da smo na dobrom putu, premda je još potrebno raditi na standardizaciji metodologije, čemu će pridonijeti i ovakva istraživanja. Problematični su zahtjevnost, vremensko opterećenje i skupoća izrade antibiograma u staničnoj kulturi, zbog čega se ona još provodi samo u specijaliziranim laboratorijima i ponajviše u znanstvene svrhe (8). Zadovoljavajuća molekularna metoda, koja bi polako ušla u rutinsku primjenu, vjerojatno bi olakšala i ubrzala čitav proces, a i tu se već naziru određeni pomaci (38).

Sa sigurnošću možemo reći da je izrada antimikrobnog profila klamidijskih izolata u zemljama s visokom stopom propisivanja antibiotika te nakon neuspjeha liječenja ključan zadatak u daljnjem razumijevanju rezistencije ovog mikroorganizma, kao i korelacije laboratorijskog nalaza / antibiogramas kliničkim ishodom. Ovo hrvatsko istraživanje jedan je od doprinosa prema ostvarenju tog cilja. U budućnosti će daljnji razvoj brzih molekularnih metoda (38, 39) olakšati određivanje čimbenika koji mogu dovesti do razvoja klinički važne rezistencije, a samim time i unaprijediti naše razumijevanje ove složene problematike. Unutarstanični život i druge značajke C. trachomatis (7, 40) daju nam rijetku priliku da budemo korak ispred malo vjerojatnog, ali ipak mogućega globalnog i klinički važnog širenja antimikrobne otpornosti.

Literatura

1. Sw LO, Kumar N, Wheeler NE. Breaking the code of antibiotic resistance. Nat Rev Microbiol 2018;16:262. DOI: 10.1038/nrmicro.2018.33.
2. Porritt AE. The discovery and development of penicillin. Med Press 1951;225:460–2.
3. Brown ED, Wright GD. Antibacterial drug discovery in the resistance era. Nature 2016;529:336–43. DOI: 10.1038/nature17042.
4. Allcock S, Young EH, Holmes M i sur. Antimicrobial resistance in human populations: challenges and opportunities. Glob Health Epidemiol Genom 2017;2:e4. DOI: 10.1017/gheg.2017.4.
5. Kåhrström CT. Entering a post-antibiotic era? Nat Rev Microbiol 2013;11:146. DOI: 10.1038/nrmicro2983.
6. O’Connell CM, Ferone ME. Chlamydia trachomatis Genital Infections. Microb Cell 2016;3:390–403. DOI: 10.15698/mic2016.09.525.
7. Ljubin-Sternak S, Meštrović T. Chlamydia trachomatis and Genital Mycoplasmas: Pathogens with an Impact on Human Reproductive Health. J Pathog 2014;2014:183167. DOI: 10.1155/2014/183167.
8. Meštrović T, Ljubin-Sternak S, Bedenić B. Technical aspects of Chlamydia trachomatis antimicrobial susceptibility testing in cell culture system. Tehnički Glasnik 2015;9:136–41.
9. Binet R, Bowlin AK, Maurelli AT, Rank RG. Impact of azithromycin resistance mutations on the virulence and fitness of Chlamydia caviae in guinea pigs. Antimicrob Agents Chemother 2010;54:1094–101. DOI: 10.1128/AAC.01321–09.
10. Suchland RJ, Geisler WM, Stamm WE. Methodologies and cell lines used for antimicrobial susceptibility testing of Chlamydia spp. Antimicrob Agents Chemother 2003;47:636–42. DOI: 10.1128/AAC.47.2.636-642.2003.
11. ESAC European Map. Outpatient antibiotic use (ESAC: 2001–2010); Country overview of antimicrobial consumption. Dostupno na: https://ecdc.europa.eu/en/antimicrobial-consumption/database/country-overview. Datum pristupa: 19. 8. 2018.
12. Golub A, Štimac D. Outpatient consumption of antibiotics in the City of Zagreb (2006–2010). Med Glas (Zenica) 2014;11:216–20.
13. Vojvodić Ž. Antimicrobial use and indication-based prescribing among general practitioners in Eastern Croatia: comparison with data from the European Surveillance of Antimicrobial Consumption project. Croat Med J 2010;51:524–33. DOI: 10.3325/cmj.2010.51.524.
14. Meštrović T. Učinkovitost azitromicina, doksiciklina i levofloksacina in vitro na urogenitalne sojeve Chlamydia trachomatis. Disertacija. Središnja medicinska knjižnica Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu; 2014.
15. Ljubin-Sternak S, Meštrović T, Vilibić-Čavlek T i sur. In vitro susceptibility of urogenital Chlamydia trachomatis strains in a country with high azithromycin consumption rate. Folia Microbiol (Praha) 2013;58:361–5. DOI: 10.1007/s12223-012-0218-2.
16. Meštrović T, Ljubin-Sternak S, Sviben M i sur. Antimicrobial Sensitivity Profile of Chlamydia trachomatis isolates from Croatia in McCoy Cell Culture System and Comparison with the Literature. Clin Lab 2016;62:357–64. DOI: 10.7754/Clin.Lab.2015.150624.
17. Donati M, Di Francesco A, D’Antuono A i sur. In vitro activities of several antimicrobial agents against recently isolated and genotyped Chlamydia trachomatis urogenital serovars D through K. Antimicrob Agents Chemother 2010;54:5379–80. DOI: 10.1128/AAC.00553-10.
18. Samra Z, Rosenberg S, Soffer Y, Dan M. In vitro susceptibility of recent clinical isolates of Chlamydia trachomatis to macrolides and tetracyclines. Diagn Microbiol Infect Dis 2001;39:177–9. DOI: 10.1016/S0732-8893(01)00221-8.
19. Takahashi S, Hamasuna R, Yasuda M i sur. Nationwide surveillance of the antimicrobial susceptibility of Chlamydia trachomatis from male urethritis in Japan. J Infect Chemother 2016;22:581–6. DOI: 10.1016/j.jiac.2016.06.010.
20. Meštrović T, Ljubin-Sternak S. Molecular mechanisms of Chlamydia trachomatis resistance to antimicrobial drugs. Front Biosci (Landmark Ed) 2018;23:656–670. DOI: 10.2741/4611.
21. Jones RB, van der Pol B, Martin DH, Shepard MK. Partial characterization of Chlamydia trachomatis isolates resistant to multiple antibiotics. J Infect Dis 1990;162:1309–15. DOI: 10.1093/infdis/162.6.1309.
22. Lefèvre JC, Lépargneur JP, Guion D, Bei S. Tetracycline-resistant Chlamydia trachomatis in Toulouse, France. Pathol Biol (Paris) 1997;45:376–8.
23. Lefèvre JC, Lépargneur JP. Comparative in vitro susceptibility of a tetracycline-resistant Chlamydia trachomatis strain isolated in Toulouse (France) Sex Transm Dis 1998;25:350–2. DOI: 10.1097/00007435-199808000-00005.
24. Somani J, Bhullar VB, Workowski KA, Farshy CE, Black CM. Multiple drug-resistant Chlamydia trachomatis associated with clinical treatment failure. J Infect Dis 2000;181:1421–7. DOI: 10.1086/315372.
25. Misiurina OIU, Shipitsina EV, Finashutina IUP i sur. Analysis of point mutations in the ygeD, gyrA and parC genes in fluoroquinolones resistant clinical isolates of Chlamydia trachomatis. Mol Gen Mikrobiol Virusol 2004;3:3–7.
26. Bhengraj AR, Vardhan H, Srivastava P, Salhan S, Mittal A. Decreased susceptibility to azithromycin and doxycycline in clinical isolates of Chlamydia trachomatis obtained from recurrently infected female patients in India. Chemotherapy 2010;56:371–7. DOI: 10.1159/000314998.
27. Demars R, Weinfurter J, Guex E, Lin J, Potucek Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol 2007;189:991–1003. DOI: 10.1128/JB.00845-06.
28. Joseph SJ, Didelot X, Gandhi K, Dean D, Read TD. Interplay of recombination and selection in the genomes of Chlamydia trachomatis. Biol Direct 2011;6:28. DOI: 10.1186/1745-6150-6-28.
29. Demars R, Weinfurter J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro: mechanism and significance. J Bacteriol 2008;190:1605–14. DOI: 10.1128/JB.01592-07.
30. Sayada C, Denamur E, Grandchamp B, Orfila J, Elion J. Denaturing gradient gel electrophoresis analysis for the detection of point mutations in the Chlamydia trachomatis major outer-membrane protein gene. J Med Microbiol 1995;43:14–25. DOI: 10.1099/00222615-43-1-14.
31. Srinivasan T, Bruno WJ, Wan R, Yen A, Duong J, Dean D. In vitro recombinants of antibiotic-resistant Chlamydia trachomatis strains have statistically more breakpoints than clinical recombinants for the same sequenced loci and exhibit selection at unexpected loci. J Bacteriol 2012;194:617–26. DOI: 10.1128/JB.06268-11.
32. Fry AM, Jha HC, Lietman TM i sur. Adverse and beneficial secondary effects of mass treatment with azithromycin to eliminate blindness due to trachoma in Nepal. Clin Infect Dis 2002;35:395–402. DOI: 10.1086/341414.
33. Leach AJ, Shelby-James TM, Mayo M i sur. A prospective study of the impact of community-based azithromycin treatment of trachoma on carriage and resistance of Streptococcus pneumoniae. Clin Infect Dis 1997;24:356–62. DOI: 10.1093/clinids/24.3.356.
34. Škerk V, Schönwald S, Strapac Z i sur. Duration of clinical symptoms in female patients with acute urethral syndrome caused by Chlamydia trachomatis treated with azithromycin or doxycycline. J Chemother 2001;13:176–81. DOI: 10.1179/joc.2001.13.2.176.
35. Magri V, Marras E, Škerk V i sur. Eradication of Chlamydia trachomatis parallels symptom regression in chronic bacterial prostatitis patients treated with a fluoroquinolone-macrolide combination. Andrologia 2010;42:366–75. DOI: 10.1111/j.1439-0272.2009.01033.x.
36. Cantón E, Espinel-Ingroff A, Pemán J. Trends in antifungal susceptibility testing using CLSI reference and commercial methods. Expert Rev Anti Infect Ther 2009;7:107–19. DOI: 10.1586/14787210.7.1.107.
37. Lass-Flörl C, Perkhofer S, Mayr A. In vitro susceptibility testing in fungi: a global perspective on a variety of methods. Mycoses 2010;53:1–11. DOI: 10.1111/j.1439-0507.2009.01813.x.
38. Eszik I, Lantos I, Önder K i sur. High dynamic range detection of Chlamydia trachomatis growth by direct quantitative PCR of the infected cells. J Microbiol Methods 2016;120:15–22. DOI: 10.1016/j.mimet.2015.11.010.
39. Zhang Y, Xian Y, Gao L i sur. Novel Detection Strategy To Rapidly Evaluate the Efficacy of Antichlamydial Agents. Antimicrob Agents Chemother 2017;61:pii:e02202–16.
40. Budai I. Chlamydia trachomatis: milestones in clinical and microbiological diagnostics in the last hundred years: a review. Acta Microbiol Immunol Hung 2007;54:5–22. DOI: 10.1556/AMicr.54.2007.1.2.